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克隆感受態(tài)細(xì)胞是如何被制作的?

發(fā)布時(shí)間: 2022-12-26  點(diǎn)擊次數(shù): 629次
  克隆感受態(tài)細(xì)胞的理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞,吸收周圍環(huán)境中的DNA分子,使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。
 
  它主要原理就是通過處理使細(xì)胞的通透性變大,直觀的說,使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞,便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。由于細(xì)胞膜的流動(dòng)性,這種孔洞會(huì)被細(xì)胞自身所修復(fù)。
 
  克隆感受態(tài)細(xì)胞的制作方法:
  CaCl2法:
  1、將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫(0℃)預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中,便會(huì)造成細(xì)胞膨脹,同時(shí)Ca2+會(huì)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu),促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區(qū)域,誘導(dǎo)細(xì)胞成為克隆感受態(tài)細(xì)胞;
  細(xì)胞壁通透性發(fā)生變化,極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復(fù)合物。
  聯(lián)合其它的二價(jià)金屬離子(如Mn、Co)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,則可使轉(zhuǎn)化率提高100~1000倍。
  2、此時(shí),將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激(90s),細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生劇烈擾動(dòng),并隨機(jī)出現(xiàn)許多間隙,外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達(dá),實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。
  3、將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng),篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。
 
  電轉(zhuǎn)法:
  電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài),依靠短暫的電擊,促使DNA進(jìn)入細(xì)菌,轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到109~1010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA。因操作簡便,愈來愈為人們所接受。
 

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